کشت بافت گیاهی

کشت بافت گیاهی مجموعه‌ای از تکنیک‌های مورد استفاده برای نگهداری یا رشد سلول‌ها، بافت‌ها یا اندام‌های گیاهی در شرایط استریل بر روی یک محیط کشت مغذی با ترکیب شناخته شده است. به طور گسترده‌ای برای تولید کلون‌های یک گیاه به روشی به نام ریزازدیادی استفاده می‌شود. تکنیک‌های مختلف در کشت بافت گیاهی ممکن است مزایای خاصی نسبت به روش‌های سنتی تکثیر داشته باشند، از جمله:

• کشت بافت in vitro ریزنمونه‌های سیب زمینی
• کشت بافت‌های گیاهی در بانک بذر USDA، مرکز ملی حفاظت از منابع ژنتیکی رشد می‌کند.
• تولید نسخه‌های دقیق از گیاهانی که گل‌ها، میوه‌ها یا سایر صفات مطلوب را تولید می‌کنند.
• برای تولید سریع گیاهان بالغ.
• برای تولید تعداد زیادی گیاه در فضای کاهش یافته.

تولید چندین گیاه در صورت عدم وجود بذر یا گرده افشان‌های لازم برای تولید بذر.

باززایی گیاهان کامل از سلول‌های گیاهی که از نظر ژنتیکی اصلاح شده‌اند.

تولید گیاهان در ظروف استریل این امکان را به آن‌ها می‌دهد که با کاهش بیماری‌ها، آفات و عوامل بیماری زا نیز منتقل نمی‌شوند.

تولید گیاهان از بذرهایی که در غیر این صورت شانس جوانه زدن و رشد بسیار کمی دارند، یعنی ارکیده و نپنت.

برای تمیز کردن گیاهان خاص از عفونت‌های ویروسی و تکثیر سریع این گیاهان به عنوان “ذخایر پاک” برای باغبانی و کشاورزی.

ذخیره سازی مواد گیاهی ژنتیکی برای حفاظت از گونه‌های گیاهی بومی.

کشت بافت گیاهی بر این واقعیت متکی است که بسیاری از قسمت‌های گیاه توانایی بازسازی به یک گیاه کامل را دارند (سلول‌های آن بخش‌های گیاهی احیاکننده سلول‌های توانمند نامیده می‌شوند که می‌توانند به سلول‌های تخصصی مختلف تمایز یابند). سلول‌های منفرد، سلول‌های گیاهی بدون دیواره سلولی (پروتوپلاست)، تکه‌های برگ، ساقه یا ریشه اغلب می‌توانند با توجه به مواد مغذی و هورمون‌های گیاهی مورد نیاز، برای تولید گیاه جدید در محیط کشت استفاده شوند.

تکنیک‌های مورد استفاده برای کشت بافت گیاهی در شرایط آزمایشگاهی

آماده سازی بافت گیاهی برای کشت بافت در شرایط آسپتیک و تحت هوای فیلتر شده HEPA که توسط هود لامینار جریان آرام انجام می‌شود. پس از آن، بافت در ظروف استریل، مانند ظروف پتری یا فلاسک‌ها در اتاق رشد با درجه حرارت و شدت نور کنترل شده رشد می‌کند. مواد گیاهی زنده از محیط به طور طبیعی بر روی سطوح (و گاهی اوقات فضای داخلی) خود به میکروارگانیسم‌ها آلوده می‌شوند، بنابراین سطوح آن‌ها در محلول‌های شیمیایی (معمولاً الکل و هیپوکلریت سدیم یا کلسیم) گندزدایی می‌شود. قبل از برداشت نمونه‌های مناسب (معروف به ریزنمونه) استریل می‌شوند.
ریزنمونه‌های استریل معمولاً روی سطح یک محیط کشت جامد استریل قرار می‌گیرند، اما گاهی اوقات مستقیماً در یک محیط مایع استریل قرار می‌گیرند، مخصوصاً زمانی که کشت سوسپانسیون سلولی مورد نظر باشد. محیط‌های جامد و مایع عموماً از نمک‌های معدنی به اضافه مقداری مواد مغذی آلی، ویتامین‌ها و هورمون‌های گیاهی تشکیل شده‌اند. محیط‌های جامد از محیط‌های مایع با افزودن یک عامل ژل کننده، معمولاً آگار خالص شده تهیه می‌شوند.

ترکیب محیط، به ویژه هورمون‌های گیاهی و منبع نیتروژن (نیترات در مقابل نمک‌های آمونیوم یا اسیدهای آمینه) تأثیرات عمیقی بر مورفولوژی بافت‌هایی دارد که از ریزنمونه اولیه رشد می‌کنند. به عنوان مثال، بیش از حد اکسین اغلب منجر به تکثیر ریشه‌ها می‌شود، در حالی که سیتوکینین بیش از حد ممکن است شاخه‌ها را تولید کند. تعادل اکسین و سیتوکینین اغلب باعث رشد غیر سازماندهی سلول ها یا کالوس می‌شود، اما مورفولوژی رشد به گونه‌های گیاهی و همچنین ترکیب محیط بستگی دارد. قطعات معمولاً برش داده می‌شوند و در محیط‌های جدید زیر کشت می‌شوند تا امکان رشد یا تغییر مورفولوژی محیط فراهم شود. مهارت و تجربه کارشناس کشت بافت در نحوء کشت و قرارگیری در محیط بسیار مهم می‌باشد.

همانطور که شاخه‌ها از یک کشت بیرون می‌آیند، ممکن است آنها را برش داده و با اکسین ریشه بزنند تا گیاهچه تولید شود که وقتی بالغ شد، می‌تواند برای رشد بیشتر در گلخانه به عنوان گیاهان عادی به خاک گلدان منتقل شود.

تفاوت‌های خاص در پتانسیل بازسازی اندام‌ها و ریزنمونه‌های مختلف توضیحات مختلفی دارد. عوامل مهم عبارتند از تفاوت در مرحله سلول‌ها در چرخه سلولی، در دسترس بودن یا توانایی انتقال تنظیم کننده‌های رشد درون زا، و قابلیت‌های متابولیکی سلول‌ها. متداول ترین ریزنمونه‌های بافتی، انتهای مریستمی گیاهان مانند نوک ساقه، نوک جوانه‌های جانبی و نوک ریشه هستند. این بافت‌ها دارای سرعت بالایی از تقسیم سلولی هستند و مواد تنظیم کننده رشد مورد نیاز از جمله اکسین‌ها و سیتوکینین‌ها را متمرکز یا تولید می‌کنند.

راندمان باززایی ساقه در کشت بافت معمولاً یک صفت کمی است که اغلب بین گونه‌های گیاهی و درون گونه‌های گیاهی در میان زیرگونه‌ها، واریته‌ها، ارقام یا اکوتیپ‌ها متفاوت است. بنابراین، بازسازی کشت بافت می‌تواند پیچیده شود، به ویژه زمانی که بسیاری از روش‌های بازسازی باید برای ژنوتیپ‌های مختلف در یک گونه ایجاد شود.

سه مسیر متداول بازسازی کشت بافت گیاهی عبارتند از تکثیر از مریستم‌های از قبل موجود (کشت ساقه یا کشت گره)، اندام زایی و جنین زایی غیرزیگوتیک.

تکثیر شاخه‌ها یا بخش‌های گرهی معمولاً در چهار مرحله برای تولید انبوه گیاهچه از طریق تکثیر رویشی آزمایشگاهی انجام می‌شود، اما ارگانوژنز یک روش استاندارد ریزازدیادی است که شامل بازسازی بافتی اندام‌های ناخواسته یا جوانه‌های جانبی به طور مستقیم یا غیرمستقیم از ریزنمونه‌ها است. جنین زایی غیرزیگوتیک یک مسیر رشدی قابل توجه است که بسیار قابل مقایسه با جنین های زیگوت است و مسیر مهمی برای تولید انواع سوماکلونال، تولید دانه‌های مصنوعی و سنتز متابولیت‌ها است. به دلیل منشاء تک سلولی جنین‌های غیرزیگوتیک، آنها در چندین سیستم بازسازی برای ریزازدیادی، دستکاری پلوئیدی، انتقال ژن و تولید بذر مصنوعی ترجیح داده می‌شوند. با این وجود، بازسازی بافت از طریق ارگانوژنز نیز برای مطالعه مکانیسم‌های تنظیمی رشد گیاه مفید است.

کشت بافت آناناس

پيشرفت‌های علمی اخير در زمينه بيوتكنولوژی گياه آناناس روش‌های جديدی را برای ريزازديادی آناناس، تكثير انبوه و كاهش هزينه‌های توليد فراهم ساخته است. تغييرات ژنتيكی همراه با ريزازديادی ارقام جديدی از گياهان آناناس را بوجود آورده كه از نقطه نظر اقتصادی، مقاومت به آفات و بيماری‌های اساسی بعنوان مهمترين اهداف كاربرد بيوتكنولوژی آناناس هستند. آناناس در مقايسه با ساير ميوه‌های خوراكی كمترين توسعه ژنتيكی را داشته است. توليد گياه آناناس براساس كوليتوارهای موجود در طبيعت انجام شده است.

بيوتكنولوژی گياه آناناس در 5 زمينه مختلف فعاليت می‌كند:

1. ريزازديادی گياهان آناناس.
2. تكوين گياه آناناس از طريق توسعه ژنوتيپ‌های جديد با مقاومت به آفات و بيماری‌ها.
3. توليد گياهان بردبار نسبت به دمای پائين (پائين تر از 16درجه سانتی گراد) و خشكی.
4. توسعه ميوه‌هاب با كيفيت بالا و قابل انباركردن.
5. انتقال داخلب و بين المللب ژرم پلاسم.

گياه آناناس عضوی از خانواده Bromeliaceae يا  Bromeliad است، که اين خانواده حدود 45 جنس و 2000 گونه دارد. از نظر طبقه بندی گياهی بصورت زير است :

اولين بار آناناس توسط کريستوف کلمب از اروپا به جزاير گوادالپ در سال 1493 برده شد. مردمان جزيره گياه آناناس را بدليل شکل مخروطی ميوه آن pina ناميدند. گياه شناسان بدليل وجود گونه‌های وحشی آناناس در مناطق جنوب شرقی برزيل، پرتغال و شمال آرژانتين اين نواحی را مبدا اوليه می‌دانستند. براساس شواهد بدست آمده، منشا اوليه آن‌ را در آمريکای جنوبی مناطق شمالی تر در بين عرض‌های جغرافيايی 10 درجه شمال و جنوبی و 55 تا 75 درجه شرقی فرض کردند. اين نواحی، شمال شرقی و غربی برزيل، سرتاسر کلمبيا و گينه و مناطقی از ونزوئلا را در برمی‌گيرد، سپس آناناس از آمريکا به اسپانيا و پرتغال صادر شد و به سرعت به آفريقا و در سال 1550 به جنوب هندوستان رسيد. قبل از پايان قرن شانزدهم به چين، جاوه و فيلیپين برده شد.

امروزه آناناس تقريبا در سراسر مناطق گرمسيری و نيمه گرمسيری جهان گسترش يافته و ميوه آن از نظر تجارتی ارزش اقتصادی فراوانی دارد.

اطلاعات سيتولوژيکی و ژنتيکی از مرکز تحقيقاتی آناناس در هاوايی بدست آمد. با شمارش کروموزوم گروه‌های Cayenne ،  Queen ، Spiny Samoa ، Ruby،  Pernumbuco، Spiny Guatemala  (هيبريد بين گروه Cayenne  و تيپ وحشی ناشناخته برزيلی) و Bromelia pinquin L. نشان داد که آناناس ارقامی با تعداد کروموزوم n=25 و B. pinquin  با تعداد کروموزوم n=48 است (Collins 1960).

زاد آوری و اهداف گزينش در مناطق مختلف به مقاومت در مقابل بيماری و آفات تاکيد داشتند اخيرا توسعه کولتيوارها بر اساس بخش گوشتی ميوه متمرکز شده است.

در هاوايی، اکنون کلون‌های هيبريد پيشرفته مشتق شده طی ساليان طولانی زادگيری در مراحل آزمايشی کشت تک منظوره هستند. در استراليا، منابع ژرم پلاسم شامل گزينش‌های کلون‎‌های “Cayeene” از Queensland، جمعيت‌های هيبريد، گياهان کشت مريستم کلون‌های شناخته شده می‌باشد (Winks & Glennie 1981). گزينش‌های هيبريد از برخوردهای Cayenne با تيپ‌های برگ- خشن مانند Queen، Ripley Queen، MacGregor، Alexandera و Collard مشتق شده‌اند. Singapore Spanich يک گياه بدون خار با ميوه با کيفيت خوب به طور گسترده در برنامه زادآوری استفاده شده است. کليد شناسايی گياهان جنس‌ها و گونه‌ها و صفات اصلی 5 کلون Cayenne را توسعه داد. تنوع ايزوآنزيمی آناناس 5 گروه متنوع از نظر ژنتيکی را نشان می‌هد که کاملا با گروه بندي‌های ژنتيکی آن‌ها مطابقت داشتند.

آناناس گياهی است که برگ‌های نيزه‌ای و خشک دارد. اين برگ‌ها روی هم قرار گرفته و يک مجرای باريک (گلدان) را تشکيل می‌دهند. اين گياهان روی شاخه‌های بلند می‌رويند و از مواد معدنی حاصل از مواد آلی مرده گياه که در مجرای باريک جمع شده است تغذيه می‌کنند. در حقيقت پرورش آناناس به منظور توليد ميوه آن است و بعضی از آن‌ها زيباترين گياهان گلدانی را تشکيل می‌دهند. زادگاه اين گياه برزيل است. برگ‌های خاردار و چرم مانند پشت سر هم است به طوری که در وسط برگ‌ها حفره‌ای بوجود می‌آيد که شاخه گل دهنده از همان محل ظاهر می‌گردد. برای ميوه دادن 3 تا 4 سال وقت لازم است و پس از ظهور و رسيدن ميوه آن اندام گياه مادری به تحليل رفته و خشک می‌شود و هماهنگ با اين خشک شدن پاجوش‌ها از کنار پايه مادری شروع به ظهور می‌نمايند.

در گياه بالغ برگ بطول 35-30 سانتی متر و چماقی شکل و قطر آن در زير بخش راسی 5/7-5/6 سانتی متر است. ميانگره‌ها کوتاه در حد 1 تا  10 ميلی‌متر که در بخش‌های ميانی ساقه بلندتر هستند. در هر گره يک جوانه جانبی وجود دارد. قلمه‌ها و پاجوش‌ها از جوانه‌های جانبی بوجود می‌آيند و برای کاشتن استفاده می‌شوند. قلمه‌های واقعی اندام‌های هوايی توليد شده در راس براکته‌های گلدار بر روی دمگل می‌باشند، پاجوش‌ها اندام‌های هوايی از جوانه‌های جانبی هستند که نهال‌های زراعی را بوجود می‌آورند. پاجوش‌ها تا زمان رسيدن محصول يا تا زمان گلدهی پيوسته رشد می‌کنند، پس از نظر اندازه بزرگتر از قلمه‌ها هستند. وزن آن‌ها 250 تا 450 گرم و تاجشان 100 تا 350 گرم است.